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超解像顕微鏡

N-SIM S

毎秒15フレームの高速超解像イメージング

ニコンは、画期的なパターンモジュレーション技術を採用した高速構造化照明システムを新たに開発。圧倒的な速さと高い精度で、照明パターンの切換えを可能にしました。この新システムにより、超解像顕微鏡N-SIM Sは毎秒15フレーム*の高速画像取得を実現し、ライブセル内の動態を超解像でタイムラプス取得できます。

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    512×512画素を2D-SIMモードで2 msec露光時。

COS7細胞のエンドソームをYFPで標識。エンドソームの速い動きを高解像度で取得。動画は落射蛍光観察との対比。
画像取得速度:6 fps
画像取得モード:3D-SIM
撮影ご協力:東京大学大学院 理学系研究科物理学専攻 岡田康志先生

NG108細胞の成長円錐。アクチン繊維をGFP-Lifeactで標識。アクチン繊維の形成を高速で取得。動画は落射蛍光観察との対比。
画像取得速度:10 fps
画像取得モード:TIRF-SIM
撮影ご協力:産業技術総合研究所(AIST)バイオメディカル研究部門 田中みなみ先生、加藤薫先生

ヒストンH2B-GFPを発現したHeLa細胞。異なる場所でのクロマチンドメインの微細な動きを観察。動画は落射蛍光観察との対比。
画像取得速度:3.9 fps
画像取得モード:3D-SIM
撮影ご協力:東京工業大学 科学技術創成研究院 細胞制御工学研究センター 木村宏先生、佐藤優子先生

従来の光学顕微鏡の2倍の解像力

N-SIM Sは、構造化照明顕微鏡法(Structured Illumination Microscopy)を採用した超解像顕微鏡です。画期的なイメージング法とニコンの高度な光学技術を組み合わせることで空間分解能を従来の光学顕微鏡の2倍(115nm*)まで向上させ、生細胞内の微細構造や物質の動きの超解像による可視化を実現しました。

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    直径100 nmのビーズを3D-SIMモードで488 nmレーザー励起した場合の半値幅。TIRF-SIMモードでは直径40 nmのビーズを用いた488 nmレーザー励起で86 nmを達成。

超解像画像(3D-SIM)

従来の光学顕微鏡画像

YFPで標識したB16腫瘍細胞の微小管
対物レンズ:CFI アポクロマートTIRF 100XC Oil (NA1.49)
取得時間:約1.8秒/枚(動画)
画像構築方式:スライス
撮影ご協力:国立研究開発法人理化学研究所 生命システム研究センター細胞極性統御研究チーム 岡田康志先生

超解像画像(3D-SIM)

従来の光学顕微鏡画像

GFPで標識したHeLa生細胞の小胞体
対物レンズ: CFI アポクロマートTIRF 100XC Oil (NA1.49)
取得時間: 約1.5秒/枚(動画)
画像構築方式:スライス
撮影ご協力: 福島県立医科大学医学部附属生体情報伝達研究所 和田郁夫先生

照明モードや波長の切換えを自動化

新開発の高速構造化照明システムは、サンプルの速い変化が取得できるだけでなく、多彩な照明モードの切換え、波長・倍率に応じた最適な構造化照明パターンの調整も自動的に行えます。これにより、高速での2色TIRF-SIMイメージング、SIMモードを切り換えるイメージングなどが可能になりました。N-SIM Sはシングルモードファイバーとマルチモードファイバーの切換えを自動化。さらに波長切換え時の光軸ズレも自動で補正でき、あらゆる実験系において、かつてない使いやすさをお約束します。

広視野の超解像画像を取得

66 μm×66 μmの広視野で超解像画像が取得できるため、これまで一部しか捉えることのできなかった細胞の全体像が一度に撮影可能となりました。神経細胞をはじめとする、広い領域での画像取得が必要なサンプルやアプリケーションにおいて、非常に高いスループットで一度により多くの情報を捉えることができます。

Alexa Fluor ® 488でF-アクチン(緑)を、Alexa Fluor ® 555で微小管(オレンジ)を標識したNG108細胞の成長円錐を2色TIRF-SIMイメージング
再構築画像サイズ:2048×2048画素(66 μm×66 μm:100X対物レンズ使用時)
撮影ご協力:産業技術総合研究所(AIST)バイオメディカル研究部門 石山静葉先生、加藤薫先生

2D/3D/TIRF、多彩なモードでの超解像観察を1台で実現

TIRF-SIM/2D-SIMモード

高コントラストな超解像2次元画像を高速取得します。TIRF-SIMモードは従来のTIRF顕微鏡の2倍の分解能で全反射照明蛍光観察が行えるため、細胞膜近傍におけるタンパク質の相互作用などがより詳細に観察できます。

TIRF-SIM画像

従来のTIRF画像

YFPで標識したB16腫瘍細胞の形質膜
撮影ご協力:国立研究開発法人理化学研究所生命システム研究センター 細胞極性統御研究チーム 岡田康志先生

3D-SIMモード

3D-SIMモードは、3次元の構造化照明パターンにより、水平解像度・Z軸方向解像度をともに従来の顕微鏡の2倍に向上しました。サンプルの厚さや取得速度などに応じて、スライス画像構築・スタック画像構築の2つの画像再構築方法から選択できます。
スライス画像構築は、Z 軸方向の高分解能により光学切片厚269 nmのセクショニング画像が生成可能で、特定の深度における生細胞イメージングに適しています。Gustafssonの理論に基づくスタック画像構築は、スライス画像構築よりも厚みのあるサンプルを、より高いコントラストでイメージング可能なため、ボリュームデータの取得に適しています。
ニコン独自の復元アルゴリズムにより、1レイヤーでの3D-SIM復元計算ができ、焦点面前後のボケ光を排除できます。

3D-SIM画像

従来の光学顕微鏡画像

膜色素Nile Red(赤)で染色し、GFP(緑)と融合した細胞分裂タンパク質DivIVAを発現した枯草菌バクテリア。
超解像顕微鏡により、細胞分裂中のタンパク質の局在を正確に可視化できます。
画像構築方式:スライス
撮影ご協力:Drs. Henrik Strahl and Leendert Hamoen, Centre for Bacterial Cell Biology, Newcastle University

3D-SIM(Volume view)

3D-SIM(Maximum Intensity projection)

ケラチン中間径フィラメントを間接免疫染色し、Alexa Fluor ® 488標識二次抗体で可視化したマウスのケラチン生成細胞。
画像再構築方法:スタック
撮影ご協力: Dr. Reinhard Windoffer, RWTH Aachen University

同時2色イメージングにも対応

オプションのTwo Camera Imaging Adapter *を介して顕微鏡に2台のsCMOSカメラを搭載することで、同時2色イメージングが可能です。

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    製造元:アンドール・テクノロジーLtd.

アクチン線維(緑)にGFP-LifeActを、微小管(赤)にmCherry-tubulinを発現した、NG108細胞の成長円錐。
撮影ご協力:産業技術総合研究所(AIST)バイオメディカル研究部門 脳遺伝子研究グループ 加藤薫先生

共焦点観察と超解像観察を簡単切替え

一台の顕微鏡にN-SIM Sと共焦点顕微鏡A1 +/A1R +を搭載し、2つのシステムを簡単に切り替えて使用することが可能です。共焦点画像上でSIM画像の位置を指定し、超解像観察に切り替えて画像取得できます。

共焦点顕微鏡A1 + (1X zoom)と超解像顕微鏡(3D-SIM)の相互観察例。広い視野を共焦点顕微鏡で観察し、より詳細に解析したい領域を超解像顕微鏡で観察可能です。
チューブリンをAlexa Fluor ® 488で、アクチンをAlexa Fluor ® 568で染色。
撮影ご協力:産業技術総合研究所(AIST)バイオメディカル研究部門 脳遺伝子研究グループ 加藤薫先生

構造化照明顕微鏡法(Structured Illumination Microscopy)の原理

ストライプ状照明から生まれるモアレ縞を読み取り、画像処理で構造を復元

既知の高空間周波数のパターン照明を照射することによって、微細構造の超解像情報が「モアレ縞」として取得できる。

ある特定の濃淡パターンで照明することを「構造化照明」といい、標本の微細構造の上にストライプ状の照明パターンを重ねると、モアレには回折限界を超える細かい標本の情報も変調されて含まれているため、モアレを撮像して、画像演算によって元の構造を復元することで、顕微鏡の分解能を超えた細かい構造もイメージング可能になります。これが、構造化照明顕微鏡法です。

複数画像からの超解像画像構築

構造化照明で得られたモアレ画像には、サンプル内の微細構造の情報が含まれています。
構造化照明された1枚の取得画像では情報が不足するため、位相と方向を変えて複数枚の画像を取得したのち、得られたモアレ縞から画像演算により微細構造を抽出して、従来の2倍の解像度の超解像画像を構築します。

高周波ストライプ状照明を利用して、2倍に解像力を向上

顕微鏡の解像力を上げるには、広がり角の大きな回折光を顕微鏡に取り込む必要がありますが、実際に取り込める角度は対物レンズのNAで制限されるため、対物レンズのNAよりも大きな広がり角を持つ、標本の微細構造からの回折光を取り込むことは不可能でした。(図A)
ところが、標本に構造化照明を施すと、対物レンズのNAよりも大きな広がり角をもつ標本からの回折光を対物レンズで取り込める角度に変換することができます(図B)。そのときに生じるモアレパターンを利用することにより、あたかもNAが2倍になったかのような解像力が得られます(図C)。

図A:NAで解像力が制限される

図B:構造化照明により、大きな角度の光束を回折させ、NAで取り込める角度に変換

図C:あたかも2倍のNAを持つ対物レンズで取得したかのような画像を取得

超解像顕微鏡に最適な対物レンズ

シリコーン浸対物レンズ

屈折率が生細胞に近いシリコーンオイル(ne≒1.40)を浸液に使用することで、標本である細胞(ne≒1.38)との屈折率の差による球面収差を低減し、表面からの深部まで高解像度の多色3次元観察が可能です。高い粘性により、長時間のタイムラプス観察にも最適です。幅広い波長領域における優れた色収差補正と高い透過率を実現しています。

CFI SR HP プランアポクロマート Lambda S 100XC Sil

ニューロンを発現したtdTomato標識マウスの脳切片

イマージョン対物レンズ

SR対物レンズは、厳格な検査と調整を経て、レンズの偏心誤差を極限まで低減。超解像顕微鏡に理想的な光学性能を実現しています。HP対物レンズは、高出力レーザーに対応し、軸上色収差を低減。N-STORMとの同時搭載システムにおいても、対物レンズの切替えが不要です。ACタイプの対物レンズは、倒立顕微鏡Ti2-Eの電動補正環を使用することで、補正環の高精度な調節が簡単に行えます。

CFI SR HP アポクロマート TIRF 100XC Oil

CFI SR プランアポクロマート IR 60XC WI

CFI SR HP アポクロマート TIRF 100XAC Oil

ドライ対物レンズにも対応

N- SIM Sは、共焦点顕微鏡と同様にドライ対物レンズが使用できるため、対物レンズを変更することなく簡単に共焦点観察と超解像観察が切り替えられます。低倍率・広視野のドライ対物レンズにより、組織サンプルの周辺部においても高解像度の画像取得が可能です。

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    ドライ対物レンズは、2D-SIMと3D-SIM(スライス画像構築)に対応。

CFI プランアポクロマート Lambda 60XC(NA 0.95)

CFI プランアポクロマート Lambda 40XC(NA 0.95)

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